第115期层析分离,是否一定要评价柱效?

2019年01月23日source:管理员
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     有人问到:“我的工艺是流穿模式,是否需要评价柱效?”还有人问到:“我的工艺是亲和层析,单梯度洗脱,不用担心拖尾,是否需要评价柱效?”今天,小编为大家进行统一解答。

什么是柱效?

     柱效(column efficiency),是指层析柱保留某一物质而不使其扩散的能力。柱效越高,则分离度越高。

塔板理论及柱效评价标准

      马丁(Martin)和欣革(Synge)最早提出塔板理论,将层析柱比作蒸馏塔,把一根层析柱设想成由许多小段组成。在每一小段内,一部分空间为固定相占据,另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入层析柱后,就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡,这样一个小段称作一个理论塔板(theoretical plate)。经过多次分配平衡,分配系数小的组分先离开蒸馏塔,分配系数大的组分后离开蒸馏塔。

理论塔板数(N)计算公式:


      该公式中的Ve,必须从进样时起算。

      每米理论塔板数(N/m)=理论塔板数(N) ÷ 柱床高度。

      HETP(height equivalent of theoretical plate),理论塔板等量高度,即每一层理论塔板的高度。

      简单来说,每米理论塔板数,是指每米有多少层;HETP,是指每一层有多高。可以说两者是互为倒数的关系。

     评价标准:一般情况下,认为HETP <4倍粒径大小即为比较理想的柱效。比如装填平均粒径90 μm的Sepharose填料,则要求HETP <360 μm,通过计算,要求每米理论塔板数 >2778。或可根据实际情况,将柱效标准定为每米理论塔板数 ≥3000。

对称性,也称峰不对称因子(Asymmetry, As),用来评价层析柱装填的均匀程度。


      As =b/a。As >1,说明装填偏松,表现为峰拖尾;As <1,说明装填偏紧,表现为峰前沿。若对分离度有较高要求,可把标准定为0.8 <As <1.2;若对分离度要求并不高,可把标准定为0.8 <As <1.5,甚至更宽的范围。

 

是否一定要评价柱效?

      总体来说,还是建议进行柱效评价的,但柱效评价标准不能一概而论。

      高标准:1)分子筛层析;2)反相层析;3)疏水层析;4)采用阶性梯度或线性梯度洗脱的离子交换层析。此类层析对分离度有较高要求,有些需要采用多梯度洗脱或线性洗脱,如果柱效不佳,往往会造成峰扩散或拖尾,会对纯化效果产生很大影响。建议标准:HETP <4倍粒径,0.8 <As <1.2。

      低标准:1)亲和层析;2)采用单梯度洗脱的离子交换层析。此类层析仅需采用单梯度洗脱,有时在产物洗脱下来后,还要立即进行稀释,以防产物聚集,因此对分离度要求较低。然而,过于严重的峰扩散和拖尾,也是会影响纯化效率的,因此柱效测定也必不可少。建议标准:HETP <5倍粒径,0.8 <As <1.5。

      仅要求峰型及对称性:流穿模式。此类模式为目标产物流穿,杂质被吸附,如果填料装填不均匀,或者过于松散,仍会导致吸附不匀而影响载量和处理量。因此,评估柱效时建议观察一下峰型及对称性,如果峰型平滑,且对称性良好,即可接受。建议标准:0.8 <As <1.5。当然,如果装填工艺稳定,甚至进行了工艺验证,该模式也可以不进行柱效评价。

   

柱效评价的常见问题及处理

前沿峰


可能原因:压缩过紧。

解决办法:重新装填。

拖尾峰

可能原因:1)压缩过松;2)管路过粗,或检测器流通池体积过大,造成稀释效应。

解决办法:1)重新装填;2)检查管路及检测器流通池规格是否匹配。

低柱效

      可能原因:1)沉降不均匀;2)碎填料过多;3)检测器或泵故障。

      解决办法:1)降低匀浆浓度,确保搅拌均匀后一次性缓慢倒入层析柱;2)去除碎填料;3)检查检测器及泵是否正常;4)考虑更换为粒径更细的填料以提高柱效,如TOSOH聚合物基材填料(http://www.prep-hplc.com/brand/view/1.html)。

峰型不佳

      可能原因:1)柱床中心凹陷,或柱床与筛网之间存有气泡,导致样品流动不均匀(样品需要绕过凹陷区或气泡);2)装填不均匀,甚至内部有裂缝;3)筛网堵塞,导致样品流动不均匀;4)层析柱无分配器,或分配器设计不佳,导致偏流。

      解决办法:1)重新装柱,优化装柱策略;2)拆卸、清洗筛网,并确认筛网孔径是否合适;3)采用具有合理分配器设计的层析柱。

 

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